کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) از جمله تکنیک های جداسازی (Separation) مرسوم در بسیاری از علوم است.
روشهای کروماتوگرافی بر پایه دو مفهوم کلی دسته بندی می شوند: در روش اول، جداسازی بر اساس مفاهیم فیزیکی صورت گرفته و شامل دو گروه کروماتوگرافی ستونی (Column) و کروماتوگرافی سطحی است.
اساس نام گذاری در دسته بندی دوم که مرسوم تر است، نوع فاز متحرک، فاز ساکن و همچنین نوع تعادل ایجاد شده بین دو فاز است. این دسته شامل دو گروه کلی کروماتوگرافی مایع (فاز متحرک مایع می باشد) و کروماتوگرافی گازی (فاز متحرک گاز) است.
درتمامی روشهای کروماتوگرافی، جداسازی بر پایه تفاوت مقداری آنالیت )ماده مورد جداسازی) در دو فاز ساکن (Stationary Phase) و متحرک (Mobile Phase) انجام می شود .
کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا:
از میان تکنیک های جداسازی، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (High Performance Liquid Chromatography -HPLC)، بیشترین رشد و کارایی را داشته است و سالیانه میلیونها دلار صرف خرید و فروش دستگاههای HPLC در دنیا می شود. علت این رشد را می توان به حساسیت بالا، تعیین مقدار کمی با صحت بالا، قابلیت آنالیز نمونه های غیرفرار و حساس به دما نسبت داد.
خصوصیات فاز متحرک در HPLC در زیر آمده است:
• درصد خلوص بالا ( حلالهایی با درصد خلوص بسیار بالا ، HPLC Grade، در بازار موجود است که قیمت بالایی نیز دارد.)
• نقطه جوش بالاتر از دمای ستون ( به خصوص در مواردی که با گرمکن (Oven) کار می شود)
• واکنش پذیری کم (Inertness)
• قابلیت تطابق با آشکارساز
اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه HPLC
دستگاه و تجهیزات HPLC شامل قسمت های مختلفی است که در ادامه به آنها اشاره می شود:
۱- مخازن حلال: که در آنها فاز متحرک و یا حلالهای شستشو دهنده ستون ریخته شده است.
۲- موتور یا پمپ: به منظور انتقال حلال و همچنین نمونه در فضای نسبتا طویل ستون نیاز به ایجاد فشاری در سیستم است که برای ایجاد آن حداقل از یک پمپ یا موتور استفاده می شود. حلال (فاز متحرک) توسط پمپ با سرعت و جریان ثابتی بر روی فاز ساکن حرکت داده می شود. فشار سیستم به اندازه (سایز) ذرات موجود در ستون، گرانروی (Viscosity) و سرعت جریان فاز متحرک بستگی دارد. بسته به نوع جداسازی، میزان سرعت جریان فاز متحرک تعیین می گردد. در مواردی که با تعددی از آنالیت‌ها مواجه هستیم، هر گونه جدا شده خود را به صورت یک پیک در کروماتوگرام نهایی نشان می‌دهد. در سرعت جریان کمتر فاز متحرک ، فاصله بین پیک ها افزایش یافته و جداسازی بهتری خواهیم داشت.
۳- تزریق کننده (Injector): تزریق نمونه، بسته به نوع دستگاه، به دو شکل دستی و یا خودکار انجام می گیرد. در روش خودکار، نمونه در ظروف مخصوصی ریخته شده و در محل تعبیه شده در دستگاه قرار می گیرد. پس از اینکه اپراتور دستور تزریق را (از طریق نرم افزار ) می دهد، نمونه توسط یک سرنگ به سیستم منتقل می شود.
۴- ستون: پس از تزریق، نمونه ابتدا وارد قسمتی به نام پیش ستون (pre-column) یا ستون محافظ (Guard column ) می شود. نقش این ستون محافظت از ستون اصلی است. طول این ستون معمولا در حد سانتی متر است و جنس آن از فولاد ضد زنگ است. ماده پرکننده (Packing) ستون محافظ از جنسی مشابه ماده پرکننده ستون اصلی است. هم جنس بودن نوع پرکننده این مزیت را دارد که اگر ماده ای که با ذرات ستون وارد واکنش شود در نمونه موجود باشد، در ابتدا در ستون محافظ به دام افتاده وستون اصلی را دچار آسیب نمی کند. طول ستونهای اصلی دستگاه معمولا حدود ۳۰-۱۰ سانتی متر بوده و درون ستون را با موادی که به یکی از دو فرم پوسته دار و یا متخلخل است، پر کرده اند. سایز این مواد پرکننده که بر کیفیت جداسازی تاثیر فراوانی دارد متفاوت بوده و معمولا در حد ۳ تا ۵ میکرومتر است.
ستون می تواند قطبی و یا غیرقطبی باشد. از مرسوم ترین ستون های غیرقطبی میتوان به C18، اکتادسیل سیلان اشاره کرد. جنس ستونها از فولاد ضد زنگ (Stainless Steel) است. پس از ورود نمونه به ستون، بر اساس تفاوت قطبیت، اجزاء مختلف نمونه در زمان های متفاوتی با نام زمان بازداری (Retention Time) از یکدیگر جدا شده و برای تشخیص نوع ماده به سمت آشکار ساز(Detector) هدایت می شوند.
در نهایت پس از اتمام کار باید ستون را شستشو دهیم. برای شستشو، بسته به نوع ستون، حلال متفاوتی را با ترتیب خاص انتخاب می کنیم.
۵- آشکارساز (Detector): آشکارساز بر اساس نوع آنالیت انتخاب می شود. به طور کل یک آشکارساز خوب باید دارای ویژگی های زیر باشد:
* حساسیت بالا
* غیرتخریبی بودن (Nondestructive): در طول روند شناسایی نمونه را تخریب نکند.
* پاسخ خطی به غلظت در دامنه وسیع (برای سهولت در محاسبات)
اطلاعات حاصل از یک کروماتوگرام
آ ) کاربردهای کیفی:
آنالیز کیفی، برای تشخیص و شناسایی نوع ترکیبات انجام می شود. از آنجایی که زمان بازداری (Retention Time) برای هر ماده در یک سیستم و شرایط خاص آزمایشگاهی ثابت و مشخص می باشد، می توان از آن جهت تعیین نوع آنالیت استفاده کرد. به این منظور کروماتوگرام آنالیت را با کروماتوگرام به دست آمده از استاندارد آن آنالیت مقایسه می کنند. در صورت یکسان بودن زمان بازداری می توان با قطعیت نوع ماده را تعیین کرد. ذکر این نکته لازم است که این مقایسه این دو کروماتوگرام تنها در شرایط آزمایشگاهی و دستگاهی کاملاً یکسان معتبر است.
ب ) آنالیز کمی:
به منظور تعیین کمی مقدار آنالیت، سطح زیر پیک و یا ارتفاع پیک ترکیب مجهول را با نمونه استاندارد مقایسه می¬کنند. در مواردی که پیک ها باریک و متقارن باشند، اندازه گیری ارتفاع پیک از صحت و سرعت بیشتری برخوردار است. هر چند که امروزه به راحتی می توان ارتفاع و سطح زیر پیک را به کمک دستگاه های الکترونیک با دقت و صحت بالایی محاسبه کرد.
در مجموع کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا، روشی مناسب جهت جداسازی، اندازه گیری، و تعیین نوع مواد است. این تکنیک با تلفیق با روشهای دیگر و آشکارسازهای پیشرفته ای مانند طیف سنج جرمی کاربرد های زیادی در علوم مختلف دارد. انتخاب فاز متحرک و ثابت، انتخاب آشکارساز و تعیین سرعت جریان فاز متحرک از جمله موارد اساسی در تنظیمات یک روش مناسب HPLC است.
